Bloc opératoire et Exploitation et surveillance des Heater-Cooler Devices

En juillet 2014, l’Office Fédéral de la Santé Publique (OFSP), conjointement avec Swissmedic, a informé l’opinion publique que des cas isolés d’infection causée par la bactérie Mycobacterium chimaera avaient été détectés après des chirurgies cardiaques avec implants (1). Cette bactérie qui fait partie des mycobactéries non-tuberculeuses (NTM), est présente naturellement dans l’environnement, et donc également dans l’eau potable. Auparavant, M. chimaera n’était connu comme pathogène que dans de rares cas de pneumonie chez des patients atteints de pneumopathies chroniques.
Depuis lors, la bactérie a été identifiée en Suisse chez dix patients présentant des symptômes cliniques d’une infection chronique systémique, ayant subi auparavant une intervention à coeur ouvert avec pose d’implant (par exemple implantation valvulaire ou endoprothèse aortique). Les interventions chirurgicales correspondantes avaient en moyenne été réalisées deux ans auparavant. Ces interventions avaient été réalisées en utilisant des dispositifs d’hypothermie respectivement des Heater-Cooler Devices (HCDs) de la société Sorin (désormais LivaNova) de type 3T (2,3,4).
Les recherches plus avancées ont démontré que les HCDs Sorin 3T utilisés présentaient au moment des interventions une contamination microbiologique. Les cultures microbiologiques réalisées chez les patients, ainsi que dans les circuits d’eau des appareils de cardioplégie, se sont avérés positifs pour M.chimaera. Il a pu être établi que lors d’utilisation des HCDs contaminés, leur système de ventilation diffusait dans l’environnement des aérosols contaminés par des bactéries M. chimaera capables de se multiplier (3). Environ 70 patients ayant contracté une infection à M. chimaera après une intervention à coeur ouvert ou cardio-vasculaire réalisée à l’aide d’un appareil Sorin/LivaNova 3T ont été recensés dans le monde (état en décembre 2016). Selon le nombre d’interventions cardio-vasculaires effectuées avec cet appareil, le risque d’une infection à M. chimaera se situe entre 1 :100 à 1 :1000 patients, dans les hôpitaux où des cas ont été décrits (5). Des échantillons d’eau prélevés sur des HCDs d’autres fabricants se sont aussi avérés positifs pour la bactérie M. chimaera. A ce jour, aucune étude scientifique montrant que les prélèvements d’air de ces appareils pouvaient aussi être contaminés n’a été publiée. De plus, aucun cas d’infection à M. chimaera secondaire à l’utilisation d’appareils fabriqués par d’autres fabricants n’a été publié. Le fabricant des appareils concernés, ainsi que différents instituts de santé publique tel que l’European Centers for Disease Prevention and Control (ECDC), la Food and Drug Administration (FDA) américaine et le Centers for Disease Control and Prevention (CDC) ont diffusé des messages d’alerte avec la recommandation urgente de respecter les instructions actualisées du fabricant en matière de maintenance et d’utilisation des appareils (5,6,7). En raison de la formation d’un biofilm, une stérilisation permanente des HCDs contaminés par M. chimaera n’est en l’état actuel des connaissances pas possible (6). En cas de poursuite planifiée de l’exploitation d’appareils contaminés, il est recommandé, outre une maintenance périodique avec changement d’eau et désinfection selon les instructions du fabricant, de pratiquer une surveillance microbiologique des appareils (réservoirs d’eau), et spécifiquement de leur environnement au moyen d’échantillons d’eau et d’air. Etant donné que ces infections sont difficiles à traiter et qu’elles n’ont pu être identifiées qu’au terme d’un délai de latence de deux à cinq ans, la priorité absolue est de prévenir toute nouvelle contamination. Les recommandations qui suivent s’adressent en première ligne aux équipes de cardiotechniciens, qui ont la responsabilité de l’exploitation et de la maintenance des HCDs.

Méthodes pour les prélèvements et l'analyse  microbiologiques

Ces méthodes servent de référence dans les surveillances qui accompagnent l'exploitation des Heater-Cooler Devices (HCDs) en salle d’opération ». Les méthodes d'analyses servent à la détection de mycobactéries non-tuberculeuses à croissance lente; en particulier de M. chimaera et visent également à la détection des légionnelles et à l’évaluation du nombre total de germes présents dans l’eau. Les mycobactéries à croissance rapide présentes dans les prélèvements environnementaux sont en règle générale inoffensives.

Les méthodes mentionnées pour les mycobactéries ont été développées, évaluées et validées au Centre national des mycobactéries (NZM, Université de Zürich, Institut de microbiologie médicale) en collaboration avec les Services d’hygiène hospitalière de l’Hôpital Universitaire de Zürich et des partenaires étrangers dans le cadre d’une collaboration internationale (entre autres les laboratoires de référence en matière de mycobactéries aux Pays-Bas et en Allemagne). Les méthodes utilisées ont été diffusées dans la littérature spécialisée (1, 3-6). Les procédures destinées à la détection des légionnelles et à la détermination du nombre total de germes s’orientent conformément aux mesures applicables en matière d’eau potable de l’Ordonnance sur l’hygiène (RS 817.024.1). Les laboratoires expérimentés peuvent déroger aux méthodes d’identification énoncées ci-après. En cas d’utilisation de méthodes alternatives et de milieux nutritifs (par exemple Löwenstein-Jensen au lieu des milieux nutritifs Middlebrook mentionnés ci-dessous), des expérimentations de validation devraient être réalisées au préalable afin de définir la sensibilité analytique. Les analyses doivent être réalisées dans des laboratoires munis d’un système de contrôle-qualité (laboratoire accrédité). Le laboratoire doit avoir une expérience dans les analyses d’échantillons environnementaux et les examens conduits sur ces échantillons doivent entrer dans le champ des activités assujetties à un contrôle-qualité.

Traitement des échantillons pour la recherche de M. chimaera en laboratoire

Réalisation d’un prélèvement d’eau de 50 ml

1. Centrifuger l’échantillon (3'300 x g, 15 minutes, température ambiante) et décanter jusqu’à obtenir environ 5 ml
2.  Ajouter 5 ml de solution de décontamination (MycoPrepKit Sté. BD N° de commande: 240862)
3. Bien agiter (Vortex) et retourner deux fois les tubes Attention: une agitation trop importante oxyde et inactive le NALC (N-acétyl-L-cystéine) présent dans la solution de décontamination!
4. Laisser ensuite les échantillons reposer 15 minutes à température ambiante
5. Pour 30 ml de tampon phosphate (fourni sous forme de poudre à reconstituer dans le MycoPrepKit Sté. BD) remplir jusqu’à 40 ml (pour 20 ml d’échantillon, compléter jusqu’à 50 ml), reboucher soigneusement les tubes, retourner chacun des tubes plusieurs fois manuellement.
6. Centrifuger (3'300 x g, 15 minutes, température ambiante)
7. Décanter avec précaution le surnageant dans la solution désinfectante
8. Afin d’éviter toute contamination, nettoyer le bord avec un tampon imprégné d’alcool à 70%
9. Remettre en suspension le sédiment dans 2 ml de tampon phosphate, bien agiter (Vortex)
10. De cette préparation, transférer 0.5 ml dans un MGIT et ensemencer 0.25 ml sur la gélose 7H11 Middlebrook
11. Les boîtes sont incubées pendant 7 semaines à 37 °C sous 5-10% de CO2
12. Le matériel restant est stocké en tant qu’échantillon de réserve à +4 °C et conservé jusqu’à obtention du résultat final des analyses.

Réalisation d’un prélèvement d’eau d’1 litre

Appareils requis:
- Pompe à vide Sartorius N° Art. SM 16692
- Fiole à vide 2 litres Sartorius N° Art. SM 16672
- Dispositif de filtration sous vide Sartorius N° Art. SM 16201
- Flacon de Woulff Sartorius N° Art. SM 16610
 

Réalisation pratique:

1. Filtrer l’échantillon d’eau (1 litre) sur une membrane filtrante en nitrate de cellulose avec un diamètre des pores de 0.45 μm (Sté. Sartorius N° de commande: 13806-50-ACN).
2. Placer la membrane filtrante en la centrant sur la boîte 90 mm gélose 7H10 Middlebrook et presser légèrement. Les boîtes sont incubées pendant 7 semaines à 37 °C sous 5-10% de CO2.
3. Contrôler la croissance bactérienne 1x par semaine.

Pour les échantillons d’eau provenant d’appareils identifiés lors des premiers examens comme présentant une contamination polymicrobienne, il peut s’avérer indispensable de procéder à une décontamination préalable de la membrane filtrante:

1. Transférer la membrane filtrante dans un tube stérile (Sté. TTP, 50 ml)
2. Ajouter environ 7 ml de solution de décontamination (MycoPrep Kit Sté. BD - N° de commande: 240862) et traiter le tube dans un bain à ultrasons pendant 1 min. à 50-60 kHz
3. Placer 20 minutes sur l’agitateur-incubateur, puis retirer la membrane filtrante
4. Pour neutralisation, ajouter environ 7 ml de tampon phosphate
5. Centrifuger (3'300 x g, 15 minutes, température ambiante)
6. Eliminer le surnageant, remettre en suspension le sédiment dans 2 ml de tampon phosphate et en ensemencer 0.25 ml sur un milieu de culture solide et 0.5 ml dans un milieu de culture liquide (MGIT milieu liquide avec PANTA et supplément pour favoriser la croissance)
7. Incuber les milieux nutritifs pendant 7 semaines à 37 °C.

Réalisation des frottis de surface

1. Transférer le frottis dans un tube de 50 ml et compléter avec 5 ml d’eau stérilisée
2. Ajouter 5 ml de solution de décontamination (MycoPrep Kit Sté. BD - N° de commande:240862)
3. Bien agiter (Vortex) et retourner 2 fois le tube à essai 
4. Laisser reposer les échantillons 15 minutes à température ambiante
5. Remplir jusqu’à 40 ml avec 30 ml de tampon phosphate, à partir de cette étape éliminer le tampon ayant servi pour le frottis. Refermer le tube à essai, retourner plusieurs fois manuellement chaque tube.
6. Centrifuger (3'300 x g, 15 minutes, température ambiante)
7. Décanter avec précaution le surnageant dans la solution désinfectante
8. Afin d’éviter toute contamination, nettoyer le bord avec un tampon imprégné d’alcool à 70%
9. Remettre en suspension le sédiment dans 2 ml de tampon phosphate, bien agiter (Vortex)
10. De cette préparation, transférer 0.5 ml dans un MGIT et ensemencer 0.25 ml sur une gélose 7H11 Middlebrook
11. Incuber les milieux nutritifs pendant 7 semaines à 37 °C sous 5-10% de CO2.
12. Le matériau restant est stocké en tant qu’échantillon de réserve à +4 °C et conservé jusqu’à obtention du résultat final des analyses.

Traitement des plaques d’accumulation d’air

Les plaques sont incubées durant 7 semaines à 37 °C sous 5-10% de CO2.
Contrôle de la croissance 1x par semaine.

Suite de la procédure et établissement d’un rapport

Présence d’une croissance sur gélose (MGIT ou gélose 7H11 Middlebrook)

1.  Sur plaque ou MGIT jugé positif, faire la coloration de Ziehl-Neelsen.
2.  En présence de bacilles acido-alcoolo-résistants (BAAR), faire une suspension des colonies dans 3 ml de NaCl à 0.9%.
3. Utiliser 0.5 ml des colonies en suspension pour l’identification moléculaire, extraction d’ADN à l’aide de InstaGene Matrix (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) selon les instructions du fabricant
4. Réaliser une procédure d’identification moléculaire pour déterminer l’espèce; par exemple le protocole « RealTime-16S-rDNA-PCR » avec une sonde qui cible l’ARNr 16S du genre Mycobacterium, suivi par le séquençage de l’amplificat. (1, 2). Ensuite, l’analyse des homologies de séquences ARNr 16S à l’aide d’une base de données (par exemple SmartGene IDNS 16S rDNA Database; SmartGene AG, Zug ou NCBI GenBank). Les séquences16S de M. chimaera et de M. intracellulare diffèrent au niveau d’un seul nucléotide. Ceci permet la distinction des deux espèces. Alternatives: A. Systèmes commerciaux d’identification de biologie moléculaire pour les mycobactéries non-tuberculeuses (AID Autoimmun Diagnostika GmbH Mykobakterien Line Blot ou HAIN GenoType Mycobacterium AS). Attention: M. chimaera est identifié de manière erronée comme M. intracellulare par les Line Blots commercialisés. Le NZM peut réaliser l’identification des espèces à la demande. B. Identification MALDI-TOF MS: Bruker Daltonic MALDI Biotyper 3.1 Software,MALDIProtocole selon A.B. Pranada et al. (apranada@labmed.de).
5. Conserver la suspension de culture à 4 °C jusqu’au terme de l’identification de l’espèce.
6. Utiliser 0.5 ml de cette suspension de pour inoculer un tube MGIT (avec supplément pour favoriser la croissance) et 0.25 ml pour ensemencer une gélose 7H11 Middlebrook pour la collection de souches.
7. En cas d’examen microscopique Ziehl-Neelsen positif à partir du MGIT, ensemencer 0.25 ml de l’échantillon positif MGIT sur une gélose au sang cuit afin d’exclure les agents contaminants à croissance rapide.
8. Conserver le MGIT positif jusqu’à ce que la collecte des souches soit réalisée.
9.  Etablir un rapport sur les mycobactéries identifiées et l’envoyer au demandeur de l’analyse.
10. Conserver les isolats dans une collection de souches pour d’éventuelles analyses épidémiologiques.

Contamination des milieux nutritifs:

Eliminer les milieux nutritifs si on observe une contamination sur > 1/3 des fractions avec des bactéries à croissance rapide, non acido-alcoolo-résistants ou des
moisissures. Réclamer un nouvel échantillon et renouveler l’analyse.

Absence de croissance de mycobactéries au terme de 7 semaines

• Etablir un rapport mentionnant “aucune croissance de mycobactéries”, si, au terme de 7 semaines d’incubation, aucune croissance de bacilles acido-alcoolo-résistants n’est constatée.

Mise en évidence de la présence de légionnelles

Lors de tests de contrôle, la présence de légionnelles a été identifiée dans quelques appareils HCDs. Nous recommandons donc de réaliser des cultures de contrôle mensuelles avec des échantillons d’eau provenant d’appareils HCDs.

1. Prélèvement d’échantillon d‘eau (de 100 ml à 1 litre)

Réalisation d’examens en laboratoire

Procédure de filtration selon DIN EN ISO 11731-2:2008:

1. Filtrer l’échantillon d’eau (1 litre) sur une membrane filtrante en nitrate de cellulose avec un diamètre des pores de 0.45 μm (Sté. Sartorius N° de commande: 13806-50-ACN)
2.  Poser le filtre sur une gélose GVPC-Legionella
3. Incuber pendant 7 jours à 36 °C ±2 °C sous 5-10% de CO2
4. Dénombrer les colonies blanches/grises, bombées (= présomption de Legionella)
5. Préparer une sous-culture sur gélose au sang de mouton Columbia et gélose GVPC-Legionella
6. Incuber pendant 7 jours à 36 °C ±2 °C sous 5-10% de CO2:
   Croissance sur GVPC/ Croissance sur sang = absence de Legionella
   Croissance sur GVPC/absence de croissance sur sang = présomption de Legionella
7. Confirmation au moyen d’une identification moléculaire ou de tests d’agglutination au latex
8. Rapport sur l’espèce et les UFC/ml.
9. Faire collection de souches pour d’éventuelles analyses épidémiologiques.

Analyses du nombre total de germes dans un échantillon d’eau

Dans certains établissements, des HCDs dont l’eau présentait un aspect trouble ou une décoloration ont été utilisés. Les analyses de l’eau contenue dans ces appareils ont révélé une très forte contamination microbienne, avant tout par Pseudomonas sp. et d’autres bacilles à gram négatif non fermentatifs. Comme ces appareils doivent être remplis selon les instructions du fabricant avec de l’eau potable filtrée, on peut s’attendre, selon les manipulations techniques et les fonctions de filtration, à l’apparition d’une croissance microbienne. Avec les installations alimentées en eau potable survient une forte dispersion du nombre total de germes (de 0 jusqu’à 1‘200 unités formant des colonies [UFC] /ml). Dans l’appendice 2B de l’Ordonnance sur l’hygiène suisse, le seuil de tolérance fixée pour l’eau potable est de < 300 UFC/ml. Pour les analyses portant sur l’eau potable, l’OFSP a inclus «La détermination par cytométrie de flux du nombre total de cellules et du rapport quantitatif entre cellules à forte et à faible teneur en acides
nucléiques dans l’eau douce» en tant que méthode d’analyse recommandée dans le Manuel Suisse des Denrées Alimentaires (MSDA). Cette méthodologie a été développée à l‘Eawag, Département de microbiologie environnementale, et a été validée en collaboration avec 14 institutions sises en Suisse et à l’étranger.

1. Prélèvement d’échantillon d‘eau (de 100 ml à 1 litre)

 Réalisation en laboratoire

Pour une description détaillée, voir: Office Fédéral de la Sante Publique 2012: Cytometrie en flux de l’eau potable.  https://www.blv.admin.ch/dam/blv/fr/dokumente/lebensmittel-undernaehrung....
pdf.download.pdf/durchflusszytometrische-analyse-wasserproben.

Sources d‘informations complémentaires

Centre national des mycobactéries
Université de Zürich
Institut de Microbiologie médicale
Dr. Peter Keller, Directeur-adjoint
Gloriastrasse 30/32
8006 Zürich
Téléphone: +41 44 634 05 16
E-Mail: pkeller@imm.uzh.ch

Litterature 

1. Mycobacterium chimaera. Journal of Clinical Microbiology 51:1769-1773.
2. Bosshard, P. P., R. Zbinden, S. Abels, B. Böddinghaus, M. Altwegg, and E. C. Böttger. 2006. 16S rRNA gene sequencing versus the API 20 NE system and the VITEK 2 ID-GNB card for identification of nonfermenting Gram-negative bacteria in the clinical laboratory. Journal of Clinical Microbiology 44:1359-1366.
3. Kohler, P., S. P. Kuster, G. Bloemberg, B. Schulthess, M. Frank, F. C. Tanner, M. Rössle, C. Böni, V. Falk, M. J. Wilhelm, R. Sommerstein, Y. Achermann, J. Ten Oever, S. B. Debast, M. J. Wolfhagen, G. J. Brandon Bravo Bruinsma, M. C. Vos, A. Bogers, A. Serr, F. Beyersdorf, H. Sax, E. C. Böttger, R. Weber, J. van Ingen, D. Wagner, and B. Hasse. 2015. Healthcare-associated prosthetic heart valve, aortic vascular graft, and disseminated Mycobacterium chimaera infections subsequent to open heart surgery. European Heart Journal 36:2745-2753.
4. Sax, H., G. Bloemberg, B. Hasse, R. Sommerstein, P. Kohler, Y. Achermann, M. Rössle, V. Falk, S. P. Kuster, E. C. Böttger, and R. Weber. 2015. Prolonged Outbreak of Mycobacterium chimaera Infection After Open-Chest Heart Surgery. Clinical Infectious Diseases 61:67-75.
5. Schreiber, P. W., S. P. Kuster, B. Hasse, C. Bayard, C. Rüegg, P. Kohler, P. M. Keller, G. V. Bloemberg, F. Maisano, D. Bettex, M. Halbe, R. Sommerstein, and H. Sax. 2016. Reemergence of Mycobacterium chimaera in Heater-Cooler Units despite Intensified Cleaning and Disinfection Protocol. Emerging Infectious Diseases 22:1830-1833.
6. Sommerstein, R., C. Rüegg, P. Kohler, G. Bloemberg, S. P. Kuster, and H. Sax. 2016. Transmission of Mycobacterium chimaera from Heater-Cooler Units during Cardiac Surgery despite an Ultraclean Air Ventilation System. Emerging Infectious Diseases 22:1008-1013.
7. Tortoli, E., L. Rindi, M. J. Garcia, P. Chiaradonna, R. Dei, C. Garzelli, R. M. Kroppenstedt, N. Lari, R. Mattei, A. Mariottini, G. Mazzarelli, M. I. Murcia, A. Nanetti, P. Piccoli, and C. Scarparo. 2004. Proposal to elevate the genetic variant MAC-A, included in
the Mycobacterium avium complex, to species rank as Mycobacterium chimaera sp. nov. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 54:1277-1285.